細胞計數是細胞培養過程中的重要步驟,“傳統的細胞計數方法"是在顯微鏡下使用血細胞計數板人工計數。這里博大博聚為大家介紹下傳統細胞計數的詳細的步驟,供大家參考。
1、準備好血細胞計數板
1) 先用無水乙醇清潔血細胞計數板表面和蓋玻片;
2) 再用純水清潔血細胞計數板表面和蓋玻片;
3) 每次清洗后用洗耳球吹干。
4) 在血細胞計數板的計數池上方蓋上專用的蓋玻片。
注意:最好不要擦拭(shi)血細(xi)胞(bao)計數板(ban)的計數池(chi),防(fang)止標識線損壞。
2、制備(bei)細胞懸液
1) 貼壁生(sheng)長的細(xi)胞,使用(yong)胰酶消化的方法使細(xi)胞從培(pei)養瓶(ping)表面脫落(luo);
2) 漩渦混勻或使用移液器反復吹吸細胞懸液,盡量減少細胞團簇;
3) 懸浮細胞則可以直接進行取樣計數;
4) 細胞懸液濃度控制在1×106個細胞/mL左右。
注意:
a) 盡量少、盡量小的細胞團簇;
b) 如需計算活率,則需將細胞懸液按照1:1的比例加入等量的0.4%的臺盼藍染料,混勻后,靜置1~2分鐘。
3、細(xi)胞加(jia)樣(yang)
1) 移液器輕吹細胞懸液使其混合均勻;
2) 將細胞懸液與臺盼藍染料按1:1體積混合均勻;
3) 取出10uL細胞懸液,將細胞懸液滴加于血細胞計數板邊緣凹槽處,此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池。
注意:
1) 每次加樣前要混勻細胞懸液,防止細胞沉降造成取樣誤差增大;
2) 加樣過程中,要一次性將細胞懸液注入計數室,防止氣泡產生,否則要重做;
3) 加樣時不要將細胞懸液直接吹入計數池,會造成細胞分布不均勻。
4、 人工細胞計數
計(ji)數(shu)工具(ju):10X物(wu)鏡的顯微鏡、血細胞計(ji)數(shu)板。
1) 加樣后,將血細胞計數板靜置數分鐘;
2) 把血細胞計數板放置在顯微鏡的載物臺進行觀察-計數-記錄;
3) 分別計數大方格1-2-3-4中的細胞總數。
注意:
1) 計數時建議重復1-2次,取平均值,減小計數誤差;
2) 四個區域的細胞數量偏差不應超過 5%,否則要重新加樣。
3) 對橫跨刻度上的細胞,依照“數上不數下,數左不數右"的原則進行計數。
4) 為降低細胞計數誤差,濃度最好控制在1×106個細胞/mL左右;
5) 計數時,只計數完整的細胞,如有聚團細胞則按一個細胞進行計數。
5、 血細胞計(ji)數板濃度計(ji)數標準
(中國的標準:JJG 552-1988血細(xi)胞(bao)計數板試行(xing)檢(jian)定(ding)規程(cheng))
1) 如上圖所示,當血細胞計數板放上蓋玻片后,平臺與蓋玻片之間的距離 (即高度)為 0.1mm;
2) 平臺中心部分各以3mm長,3mm寬精確劃分為9個大方格,稱為計數室,每個大方格面積為1mm2,體積為 0.1mm3;
3) 細胞濃度 (mL)=(四個大方格細胞數之和)/4X2(染液稀釋倍數)X 104=?個細胞/mL。
注意(yi):如果不加入(ru)臺盼藍染料(liao),則無需乘(cheng)以2。
相信(xin)有(you)些小(xiao)伙(huo)伴(ban),即使花費很長時間熟悉,并實(shi)際接觸(chu)細胞(bao)計數(shu)操作的全部(bu)流(liu)程后,還是會有(you)結(jie)果不滿意(yi)、人工操作效率低、結(jie)果無法一目了然(ran)、細胞(bao)計數(shu)數(shu)到(dao)“眼疼(teng)"的情況。
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7、血(xue)細胞計數(shu)板(ban)上機實拍圖案例
8、細胞計數結果包括
總細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)濃(nong)(nong)度(du)、活(huo)/死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)濃(nong)(nong)度(du)、活(huo)/死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)比率、總細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)聚(ju)團(tuan)率/濃(nong)(nong)度(du)、活(huo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)聚(ju)團(tuan)率/濃(nong)(nong)度(du)、死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)聚(ju)團(tuan)率/濃(nong)(nong)度(du)等(deng)(deng)計數結果、原始圖(tu)片、識別圖(tu)片、柱狀圖(tu)、散點圖(tu)、等(deng)(deng)高(gao)線圖(tu)、報告(gao)單等(deng)(deng)…
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